توزيع يکنواختي در ژنوم برنج داشته و تنوع آللي بسيار زيادي را نشان ميدهند. فراواني نسبي سيزده تکرار مختلف دو، سه و چهار نوکلئوتيدي در ژنوم برنج برآورد شده است (23 و 73) و هم اکنون نشانگرهاي ريزماهوارهاي داراي تواليهاي تکراري GT، AT، TCT، ATT و بر روي کروموزومهاي برنج مکان يابي شده (17 و 73) و نقشههاي ژنتکي اشباع شده آنها در دسترس ميباشند (23 و 62).
اگرچه تصور کلي بر اين است که با کشف نسل جديد و خصوصيات نشانگرها، ريزماهوارهها نيز به سرنوشت ساير نشانگرها دچار خواهند شد، اما درحال حاضر کاربرد آنها رشدي محسوس و اميد بخش داشته و بيشتر از ساير نشانگرها مورد استفاده محققين قرار ميگيرند. به ويژه در برنج، با توجه به تهيه نقشه اشباع آن با 2243 نشانگر ريزماهواره (23)، به نظر ميرسد که کليه تحقيقات در زمينه ژنتيک مولکولي برنج بايد بر مبناي استفاده از اين نشانگرها متمرکز شود (7).
آللهاي يک جايگاه ژني توسط نشانگر همبارز به طور همزمان در يک فرد تظاهر مييابند. بنابراين در استفاده از نشانگرهاي همبارز امکان تشخيص ناخالصها از خالصها وجود خواهد داشت. اين مورد اجازه شناسايي ژنوتيپها و همچنين فراواني آللها را در جايگاههاي ژني خواهد داد. برخلاف اين، الگوي باندهاي مربوط به نشانگرهاي غالب به صورت وجود يا عدم وجود قطعهها، با اندازه خاص نمره دهي ميشوند. از اين رو در استفاده از اين نوع نشانگرها افراد ناخالص قابل شناسايي نخواهند بود. بنابر اين در مطالعات ژنتيک که بر پايه تجزيههاي آماري بر روي فراواني آللها (مانند تخمين تمايز و فاصله ژنتيک)ميباشند، نشانگرهاي همبارز مفيدتر خواهند بود.
2-12-1- تشخيص آللهاي ريزماهواره
اين نشانگرها همانند ساير نشانگرهاي مبتني بر PCR از طريق واکنش زنجيرهاي پليمراز تکثير شده و فرآوردههاي حاصله پس از الکتروفورز از طريق روشهاي مختلف نشاندار فلورسنت، رنگآميزي نقره44 يا رنگآميزي فلورسنت تشخيص داده ميشوند. تکثير ناحيه مورد نظر با استفاده از يک جفت آغازگر که مکمل قسمتي از تواليهاي پهلويي ناحيه تکرار شونده ميباشند، صورت ميگيرد. اين تواليها کاملاً اختصاصي ميباشند و در ژنوم کامل تنها يک بار رخ ميدهند. بنابراين حتي اگر در ريزماهوارههاي خاص، واحدهاي تکرار شونده در چندين محل متفاوت ژنوم قرار داشته باشند، PCR تنها يک محل را تکثير خواهد کرد. طول فرآورده PCR مطابق با تعداد واحدهاي تکرار شونده در آن محل متفاوت است. الکتروفورز بايد به گونهاي باشد که امکان تشخيص باندهايي که تنها در يک باز متفاوت هستند را به وجود آورد. انحصاري بودن آغازگرها موجب ميشود که در هر فرد تنها يک يا دو باند (بسته به هموزيگوت يا هتروزيگوت بودن فرد) به دست آيد (71).
محققين در سال 1993 براي اولين بار توانستند تعداد کمي ريزماهواره در تواليهاي انتشار يافته برنج شناسايي کرده و بر اساس تواليهاي بازي مجاور آنها اقدام به طراحي و معرفي آغازگرها نمايند. تکميل پروژه تعيين توالي برنج، محققين را قادر ميسازد تا ريزماهوارههاي بيشتري را شناسايي و معرفي کنند.
تنوع تعداد واحدهاي تکرار شونده در ريزماهوارهها، چند شکلي بسيار زياد آنها را موجب شده است. اين تنوع خود ناشي از نرخ بالاي جهش در اين نشانگرهاست. اين ميزان جهش در مقايسه با نرخ جهش نقطهاي بسيار بالاست و بين 9- 10 تا 10-10 ميباشد. عواملي همچون تعداد و نوع تکرار، توالي تکراري و نوترکيبي بر ميزان جهش ريزماهواره مؤثر ميباشند.
2-12-2- مزاياي نشانگرهاي ريزماهواره
1. اين تکنيک بسيار ساده بوده و استفاده از آن آسان است.
2. اين نشانگرها همبارزند و از توارث ساده مندلي تبعيت ميکنند.
3. آزمايش مبتني بر PCR است. براي مشاهده نتايج کافي است که فقط محصولات تکثير يافته را توسط الکتروفورز تفکيک نمود.
4. در کلون کردن بر اساس نقشه کاملاً مناسب هستند، زيرا شناسايي کلونهاي حامل نشانگر بطور مرسوم با استفاده از PCR انجام ميشود.
5. چند شکلي ايجاد شده شديداً تکرار پذير است (8).
6. ميتوان از بکارگيري راديوايزوتوپ ها اجتناب ورزيد زيرا که اندازه چند شکلي بين آللها براي مشاهده در ژلهاي آگارز غالباً بزرگ است.
2-12-3- مشکلات کار با ريزماهواره
2-12-3-1- اشتباهات آلل خواني45
اين اشتباهات در اثر پديده لغزش رخ ميدهند. لغزش فرايندي است كه در طي آن آنزيم DNA پليمراز در طي فرايند همانند سازي و تكثير، قادر به توليد كامل يك مجموعه DNA نيست و در قسمت هاي مختلف آن ادامه پليمريزاسيون DNA قطع ميشود و در نتيجه قطعات با اندازههاي متفاوتي را به وجود مي آورد. اين قطع عمل پليمريزاسيون DNA در اثر پديده لغزش اتفاق ميافتد. اين اندازههاي متفاوت DNA ممكن است از 1 تا 5 واحد تکرار شونده با واحد اصلي تفاوت داشته باشند. پديده حاصل از لغزش كه توليد باندهاي كوچكتر DNA است را نارسايي46 و به اين باندها اصطلاحاً باندهاي نارسا گفته مي شود. توليد چنين فرآوردههايي به مراتب کمتر از فرآوردههاي كامل DNA اتفاق مي افتد. به نحوي که معمولاً در عمل ميتوان آنها را ناديده گرفت. اما اگر با فرآورده مربوط به يک فرد هتروزيگوت همپوشاني داشته باشند، آنگاه تشخيص بين فرآوردههاي واقعي و لغزشي كار آساني نيست. نارسايي در جايگاههاي ريز ماهواره دو نوکلئوتيدي اغلب موجب ميشود که آللهاي مجاور روي هم بيفتند و در نتيجه در ژنتيک جمعيت، اين خطاها به افزايش هموزيگوتهاي غير واقعي منجر ميشوند.
2-12-3-2- آللهاي صفر47
آللهاي پوچ در جايگاههاي ريزماهوارهها آللهايي هستند که يا ضعيف تکثير ميشوند و يا پس از تکثير و تفکيک، قابل رؤيت نيستند. اين آللها در الگوي تنوع موجود در جايگاههاي ريزماهواره اي به تعداد زيادي ديده مي شوند. نوع و منشأ آللهاي پوچ اولين بار در سال 1993 در جايگاههاي ريزماهوارهاي دو نوکلئوتيدي انسان گزارش گرديد.
تغييرات به وجود آمده در اندازه DNA در اثر وقايعي مانند اضافه و حذف در توالي مورد تکثير و محل آغازگر، کيفيت پايين DNA استخراجي و جهش در درون توالي مورد نظر، باعث ايجاد آلل هاي پوچ ميشود.
2-12-3-3- اندازه نمونه مورد نياز
يکي از موارد مهم براي متخصصين ژنتيک، تعيين حداقل اندازه نمونه مورد نياز است كه براي ارزيابي تغيير پذيري ريزماهوارهها و تفسير قابل فهم دادهها ضروري ميباشد. اگر تعداد آللها در جايگاه هاي ريزماهواره خيلي زياد باشد با مقدار کم DNA نيز ميتوان تغيير پذيري آن را بررسي نمود. اگرچه در اکثر مطالعات انجام شده اندازه نمونه لازم منظور نشده است، ليكن هنگام محاسبه نسبت تعداد آلل به اندازه نمونه اهميت اين مسئله بيشتر به چشم ميآيد. فراوانيهاي آللي گزارش شده بر مبناي نسبت فوق اكثراً از 5 درصد كمتر ميباشد. تعداد جايگاههاي ژن و ميزان تغييرپذيري ريزماهواره اي نيز بر اندازه نمونه تاثير دارند. بر اساس مطالعات انجام شده اثبات شده است كه براي جايگاههاي ژن با 5 الي 10 آلل، حداقل اندازه نمونه 50 بوته بايد در نظر گرفته شود.
2-12-4- ريزماهوارهها در گياهان و برنج
ريزماهوارهها در ژنوم يوکاريوتها از فراواني و چند شکلي بالايي برخوردار بوده به طوري که در هر 10 کيلو جفت باز از توالي DNA، دستکم يک توالي ريزماهواره مشاهده ميشود (54 و 15). ريزماهواره ها در گياهان کمتر از پستانداران بوده و به طور متوسط به ازاي هر kb50 از طول ژنوم گياهان يک ريزماهواره وجود دارد (3). در گياهان آلي تخمين زده ميشود که يک دي نوکلئوتيد SSR به ازاي هر kb 100-30 وجود داشته، که اين مورد با تراکم مشابه براي SSRهاي تري و تترا نوکلئوتيد نيز صادق مي باشد (17). به عنوان مثال در دسترس بودن بيش از 2740 نشانگر ريزماهواره با متوسط تراکم هر kb 175 (با فواصل کمتر از cM1) يک نشانگر SSR در ژنوم برنج تا حد زيادي استفاده از اين نشانگرها را توجيه مينمايد (61). به همين منظور گروه بين المللي ابداع ريزماهواره برنج IRMI48جهت افزايش تراکم و کارايي نقشه SSR در برنج تشکيل گرديد (60). برآورد ميشود حدود 10000-5700 نشانگر SSR (14) در ژنوم برنج موجود باشد به طوريکه بيش از 6000 نشانگر، DNA ژنوم را با تراکمي در حدود يک نشانگر در هر cM 25/0 يا در هر kb75-100 پوشش ميدهد (60).
اخيراً مشخص شده که بخش قابل توجهي از ژنوم برنج از DNA تکرار شونده تشکيل ميشود هرچند که نحوه توزيع آن هنوز مشخص نيست (28 و 55). بطوريکه مک کوچ و همکاران (62) 2243 نشانگر SSR جديد را در برنج نقشهيابي و شناسايي کردند که بيشترين نسبت SSR در اين تحقيق مربوط به تواليهاي پلي CA با نسبت 36 درصـد بوده که بعد از آن تواليهاي پلي AT و CCG با نسبتهاي 15 و 8 درصد در مراتب بعدي قرار داشتند. ضمن اينکه توالي هاي AT و GC به ترتيب از بيشترين و کمترين تعداد تکرار برخوردار بودند (60).
نقشهيابي 121 مکان ژني ريزماهواره در برنج از فرضيه توزيع تصادفي آنها در سرتاسر ژنوم حمايت مينمايد (23). در حاليکه به عقيده مک کوچ SSR داراي توزيع تصادفي در ژنوم نبوده و مکان هاي معنيداري از خوشههاي SSR در ژنوم برنج وجود دارند که با گزارشهاي قبلي ارائه شده مبني بر اين که تواليهاي خاصي بصورت غير تصادفي در نواحي ژني سرشار از GC (که داراي توزيع غير تصادفي هستند) درون اجزايي از ژنهاي خاص نظير 5´ و3´ UTR، اينترونها و اگزونها، و نواحي بين ژني سرشار از AT همسو است. بررسي توزيع 2243 SSR در هر Mb در 12 کروموزوم برنج نيز نشان داده که تراکم آنها در کروموزومهاي مختلف نيز يکسان نميباشد (60).
2-12-5- کاربردهاي ريزماهواره
به دليل چند شکلي بالا، اين نشانگرها کاربردهاي وسيعي در تحقيقات ژنومي دارند. در مطالعات مربوط به تعيين هويت، در مسائل حقوقي و قضايي، جنايي، ديرين شناسي، آزمون انتساب، آناليز خويشاوندي، نقشه يابي ژنومي، طبقه بندي ارقام، غربال كردن هيبريدها، نشانمند کردن ژنهاي کمي و کيفي، رفتار توليد مثلي، تشخيص بيماريهايي نظير سرطان، تعيين ميزان همخوني و بخصوص در انتخاب به کمک نشانگر49 به مقدار زيادي استفاده ميشوند.
در انتخاب به کمک نشانگر بر اساس ژنوتيپ، نشانگر انتخاب کرده و تصميم گرفته ميشود. ريزماهوارهها به دليل پوشش کامل ژنوم و چند شکلي فراوان، برگزيده ترين نشانگرها براي MAS هستند (71). فوايد بالقوه انتخاب به کمک نشانگر بطور گسترده توسط پاترسون (76) بيان شده است.
2-13- نقشههاي پيوستگي ژنتيکي50
نقشه ژنتيکي گونه بصورت ترتيب خطي گروهي از ژنها تعريف ميشود که روي کروموزومها قرار گرفتهاند. چنين نقشههايي بر اساس نوترکيبي بين کروموزومهاي همولوگ در جريان تقسيم ميوز تهيه ميشوند و لذا به نقشههاي ژنتيکي، نقشههاي ميوزي نيز گفته ميشود. يک نقشه پيوستگي را ميتوان به وسيله تجزيه پيوستگي کلاسيک با استفاده از ميزان نوترکيبي بين مکانهاي ژني تهيه نمود. مراحل تهيه يک نقشه ژنتيکي با استفاده از دادههاي حاصل از تعداد زيادي از نشانگرهاي ژنتيکي را ميتوان به چهار مرحله تقسيم نمود (7):
1. ابتدا يک تجزيه پيوستگي براي تمامي ترکيبات ممکن جفت مکانهاي ژني انجام ميشود. اساس بيولوژيک اين نوع تجزيه، نوترکيبي بين کروماتيدهاي غيرخواهري در جريان ميوز است. تجزيه پيوستگي براي ترکيب دو مکان ژني با مقايسه فراواني مشاهده شده و موردانتظار در کلاسهاي ژنوتيپي انجام مي گيرد. تعداد آللها و نوع اثر آنها در مکانهاي ژني مورد مطالعه ميباشد.
2. در مرحله دوم، نشانگرها گروه بندي شده و به گروههاي پيوستگي منتسب ميشوند. معيار لازم براي انجام اين کار، نسبتهاي نوترکيبي بين هر جفت نشانگر، اطلاعات ژنوم (نظير تعداد کروموزوم) و انتخاب سطح معنيدار مناسب براي نسبتهاي نوترکيبي ميباشد. در يک نقشه اشباع شده و

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید