گرديد. جمعآوري نمونههاي برگي در ساعات اوليه صبح (10-8 صبح) که فعاليتهاي گياهي به حداقل ميرسند، انجام شد از هر بوته 4 تا 5 برگ با استفاده از قيچي بريده شد و در داخل کيسههاي نايلوني بستهبندي گرديد (شکل 3-5).
مشخصات هر بوته روي کيسه مربوطه نوشته شد و بلافاصله در داخل ظرف حاوي يخ قرار گرفته و به آزمايشگاه منتقل و نگهداري شدند. در هنگام جمعآوري نمونههاي برگي دقت زيادي انجام شد تا برگهاي سالم و جوان و عاري از هر گونه آفت يا بيماري انتخاب گردند، چرا که اين احتمال وجود داشت که DNA برخي از ميکروارگانيسمها به همراه DNA برگ استخراج شوند.
در اين مرحله ضمن تهيه مقدار مورد نياز برگ، برگهاي تازه و جوان بيشتري در دسترس و DNA حاصله از کميت و کيفيت خوبي برخوردار بوده است.

شکل3-5. عمليات نمونه برداري از نمونه هاي برگي برنج

3-4- ارزيابي صفت
در اين تحقيق صفت رنگ پايه ساقه مورد مطالعه قرار گرفت. اندازهگيري اين صفت در مرحله پنجهدهي انجام شد. بدين منظور تعداد 123 تک بوته از جامعه F2 بطور تصادفي انتخاب گرديد که تا زمان آغاز مطالعه درون کيسههاي نايلوني در يخچال 4 درجه سانتيگراد نگهداري شدند.
3-5- استخراج DNA60
در روشهاي مختلف استخراج DNA از بافتهاي گياهي موارد زير را بايد مورد توجه قرار داد:
1. شکستن ديواره سلولي، که معمولاً با آسياب کردن بافت در نيتروژن مايع يا يخ خشک انجام ميشود.
2. حذف غشاء سلولي، به طوريکه DNA آزاد شده و در معرض بافر استخراج قرار گيرد اين کار با استفاده از شويندههايي نظير 61SDS يا CTAB62 انجام ميشود.
3. حفاظت EDTA63 که يک ماده کلات کننده است براي اين کار استفاده ميشود. اين ماده به يونهاي دو ظرفيتي نظير منيزيم که کوفاکتوري ضروري براي فعاليت بيشتر نوکلئازها است متصل ميشود و از فعاليت آنها جلوگيري ميکند.
4. در جريان استخراج، DNA در اثر تکانهاي شديد شکسته خواهد شد. لذا براي جلوگيري از شکستن DNA در طول جريان استخراج بايد از تکانهاي شديد خودداري گردد.
5. به حداقل رساندن زمان بين ذوب شدن بافت برگي منجمد، آسياب کردن و تماس بافت پودر شده با محلول استخراج، اين کار از تخريبهاي آنزيمي جلوگيري خواهد کرد.
3-5-1- روش استخراج DNA
استخراج DNA از تمام 123 نمونه برنج مورد مطالعه انجام گرفت.
استخراج DNA به روش دلاپورتا و همکاران (28) و با تغييراتي به صورت زير انجام شد:
– حدود 3-1 گرم از نمونههاي تهيه شده در يک هاون چيني به همراه نيتروژن مايع به خوبي پودر شده (شکل 3-6) و مقدار 1/0 گرم از آن به لولههاي اپندرف 5/1 ميليليتري ريخته شد. نرم نمودن نمونه به پودر، در واقع موجب شکستن غشاء و ديوارههاي سلولي ميگردد.
– مقدار lµ400 از بافر استخراج ( 50 mM EDTA + PH= 0.8؛ 500 mM NaCL + 1.25% SDS + PH= 0.8 ؛ (100 mM Trisکه در حمام بن ماري دماي آن به 65 درجه سانتيگراد رسيده بود به همراه lµ 12 ميکروليتر مرکاپتواتانول64 )به ازاي هر lµ 100 بافر استخراج، lµ3 مرکاپتو اضافه شود) به هر لوله اضافه شد و به مدت يک دقيقه براي ترکيب کامل مواد برگي با ترکيبات اضافه شده، به آرامي تکان داده شد تا لايزيت اوليه65 صورت گيرد.
– 66SDS در واقع شوينده آنيوني و واسرشت کننده پروتئينها بوده که قادر است کمپلکسهاي پروتئين DNA را باز نمايد. مرکاپتواتانول نيز يک آنتياکسيدانت (ماده کاهنده) قوي بوده که از بنيانهاي تيول67 آنزيمها در برابر اکسيد شدگي محافظت مينمايد و دقيقاً قبل از استفاده به بافر استخراج اضافه ميگردد.
– نمونهها داخل حمام بن ماري با دماي 65 درجه سانتيگراد به مدت 30 دقيقه قرار گرفتند و هر 5 دقيقه به مدت 10 ثانيه به آرامي تکان داده شدند.

شکل3-6. پودر کردن نمونههاي برگي با استفاده از ازت مايع
– در اين مرحله به هر نمونه lµ200 استات پتاسيم 5 مولار اضافه و به آرامي تکان داده شد تا به حالت سوسپانسيون تبديل گرديد و سپس به مدت 15 دقيقه بر روي يخ در دماي 4 درجه سانتيگراد قرار گرفت.
– به هر لوله lµ500 محلول کلروفرم : ايزواميل الکل (24:1) اضافه کرده و به آرامي حدود 30 ثانيه تکان داده شد تا مواد داخل لوله کاملاً مخلوط شود. در ادامه نمونهها در سانتريفيوژ با سرعت 500 دور در دقيقه (rpm) به مدت 15 دقيقه قرار گرفتند (شکل 3-7). پس از عمل سانتريفيوژ 3 لايه درتيوپ تشکيل ميگردد: فاز آبي68، فاز مياني69 و فاز آلي70 (شکل 3-8). فاز آبي حاوي مولکولهاي محلول در آب بانضمام نوکلئيکاسيدها ميباشد. پروتئينها و ليپيدها در فاز آلي قرار گرفته و مواد زائد گياهي غير قابل حل نيز در فاز مياني، حد واسط دو لايه فوق به دام ميافتند و به اين ترتيب از هم جدا ميگردند. از سه لايه تشکيل شده در تيوپها، با استفاده از سمپلر و به صورت کات-تيپ، فاز آبي به آرامي برداشته شده و به لوله جديدي منتقل گرديد. لازم به ذکر است که براي دسترسي به DNA با خلوص بيشتر مرحله کلروفرم : ايزواميل الکل دو بار تکرار گرديد.

شکل 3-7. سانتريفيوژ کردن نمونهها
– جهت رسوب DNA، هم حجم نمونهها ايزوپروپانول خنک اضافه گرديد و جهت تشکيل کلاف DNA، چندين بار زير و رو شد (شکل 3-9).

شکل3-8. تشکيل سه فاز مشخص پس از افزودن کلروفرم و جدا نمودن فاز رويي
– براي رسوب و تشکيل پليت71 از فاز آبي، نمونهها با سرعت 5000 دور در دقيقه (rpm) به مدت 15 دقيقه سانتريفيوژ شده و سپس محلول روئي72 آن دور انداخته شد.
– جهت شستشوي نمکها و ساير آلودگيهاي ديگر، پليت DNA با اتانول 70% (به مقدار دلخواه ولي بيشتر از lµ300) دو بار شستشو گرديد که پس از دور ريختن اتانول جهت خشک شدن در محيط آزمايشگاه به مدت 2-1 ساعت قرار داده شدند.
– جهت استفاده از نمونههاي DNA در مراحل بعدي ارزيابي ژنوتيپي، به هر لوله (جهت حل شدن پليت DNA) lµ200 از بافر TE اضافه و به صورت شبانه73 به مدت 24 ساعت در يخچال 4 درجه سانتيگراد نگهداري گرديدند (شکل 3-10).

شکل 3-9. تشکيل کلاف DNA پس از مصرف ايزوپروپانول

شکل 3-10. افزودن TE به رسوب DNA و نگهداري آنها در فريزر 20-
3-6- بررسي کميت و کيفيت DNA استخراج شده

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید