اضافه اتفاق ميافتد اطلاق ميشود (14). البته گاهي اوقات به جهت داشتن تغييرات حذف-اضافه (indels) يا تغييرات ديگر در چند باز (3-1) نيز به آن چند شکلي ساده نوکلئوتيدي29 گفته ميشود (26 و35). تشخيص فراوردههاي SNP معمولاً به 3 روش: روشهاي مبتني بر ژل (RFLP، AFLP)، روشهاي غير مبتني بر ژل (تراشه DNA30، 31OLA، DASH32) و روشهاي غير مبتني بر PCR صورت ميگيرند.
2-7- کاربرد نشانگرهاي مولکولي
از همه انواع نشانگرهاي فنوتيپي، جابجاييهاي کروموزومي (ترانسلوکاسيونها)33، آيزوزايمها، پروتئينها و نشانگرهاي DNAدر جهت شناسايي و مکانيابي جايگاههاي صفات كمي (QTL)34 و اشباع نقشههاي لينکاژي35 استفاده شده است. اولين نقشه ژنتيکي ناقص توسط نشانگرهاي مورفولوژيک در سال 1935 براي ذرت تهيه شد (10). متأسفانه تعداد و نوع نشانگرهاي موفولوژيک کم بوده و اکثر آنها غالب و عموماً با ديگر صفات اثر متقابل دارند و به شدت تحت تاثير شرايط محيطي واقع ميشوند. مشکل اساسي در مورد اثرات ترانسلوکاسيونها، اندازه بسيار بزرگ قطعات کروموزومي مورد مطالعه است (31).
از نشانگرهاي ايزوزايمي براي مکانيابي جايگاههاي صفات كمي36 در ذرت، گوجهفرنگي، يولاف وحشي و سويا استفاده شده است. در ذرت حدود 40 نشانگر آيزوزايمي شناسايي و محل آنها روي 10 کروموزوم اين گياه معلوم شد. اين نشانگرها احتمالاً فاقد اثر فنوتيپي بوده و تعداد چنين نشانگرهايي اندک است. همچنين اين گونه نشانگرها از نظر مراحل رشدي يا اندام مورد مطالعه حالت اختصاصي دارند و يا در همه اندامها بيان نميشوند، بدين معني که مثلاً بعضي آنزيمها فقط در اندامهاي خاصي فعال هستند. همين مشکل در مورد تنوع پروتئينهايي که توسط ژلهـاي دو بعدي37 بررسي ميشوند نيز وجود دارد (10). از آنجا که اين نشانگرها هيچ اثر شناخته شدهاي روي گياه ندارند و تحت تاثير محيط نيستند، براي مطالعه صفات کمي و گزينش آن صفات به کمک نشانگر مفيد هستند.
در طول دهه 1970 و اوايل 1980 استفاده از نشانگرهاي بيوشيميايي رايج گرديد. ايزوزايمها، اولين نشانگرهاي ژنتيکي بودند که در ژنتيک گياهي و اصلاح نباتات براي شناسايي ارقام به کار گرفته شدند. سيستم شناسايي استفاده از اين نوع نشانگرها، ساده، ارزان و نسبت به نشانگرهاي موفولوژيکي از پايداري بيشتري برخوردار ميباشند. اما تعداد نشانگرهاي بيوشيميايي کم بوده و از طرفي اين نشانگرها تحت تاثير نوع بافت و فيزيولوژي گياه در زمانهاي مختلف رشد قرار ميگيرند. به دليل مشکلات فوق در دهه 1980، توجه متخصصان به سمت نشانگرهاي مولکولي مبتني بر DNA جلب گرديد. اين نشانگرها تفاوتهاي قابل توارث در تواليهاي DNA بين افراد را منعکس مينمايند .
ريزماهوارهها واحدهاي نوکلئوتيدي دو، سه، چهار تا ده تايي تکرار شوندهاي هستند که در طول ژنوم موجوات يوکاريوت مانند گياهان به وفور يافت ميشوند و به علت جهشهاي فراوان از تنوع قابل ملاحظهاي در بين افراد يک جمعيت برخوردار ميباشند. اين واحدهاي تکراري توسط دو توالي منحصر به فرد حفاظت شده در دو طرف واحد تکراري محدود شدهاند. بنابراين بر اساس اين تواليهاي حفاظت شده ميتوان آغازگرهاي اختصاصي طراحي نمود و نشانگرهاي انحصاري مبتني بر واکنش زنجيرهاي پليمراز (PCR) براي هر جايگاه را به دست آورد (72).
تا کنون ريزماهوارههاي زيادي را در محصولات مختلف گياهي مانند گندم، انگور (27)، سويا، گوجهفرنگي (97) و گلابي (102) شناسايي نمودند. اسکورا و همکاران (89) نشان دادند که ريزماهوارهها ابزار قوي در شناسايي ژنوتيپها و نگهداري واريتهها به شمار ميروند.
2-8- انتخاب ميان انواع مختلف نشاگرها
انتخاب روش انگشت نگاري DNA38 بستگي به تجربيات و يافتههاي علمي، بعلاوه احتياجات و ملزومات يك آزمايش دارد (83). جهت انتخاب نشانگرهاي مولکولي مناسب، ضروري است ابتدا مقايسهاي بين آنها صورت گيرد. نشانگرها اغلب بر حسب سهولت کار، تکرار پذيري، سرعت شناسايي و هزينه، مورد مقايسه قرار ميگيرند (31).
نشانگرهاي RAPD از لحاظ پارامترهاي هتروزيگوستي و نسبت چندگانه در حد متوسط قرار دارند و نشانگرهاي RFLP از هتروزيگوستي متوسطي برخوردار هستند. تحقيقات بر روي ژنوم گندم و جو نيز مؤيد اين مطلب ميباشد (83). استفاده از نشانگرهاي RAPD ساده است ولي نشانگر SSR ابتدا نيازمند به جداسازي و مشخصه سازي ريزماهواره ميباشد (87). هر چند که در استفاده از روشهاي مولکولي جهت ژنوتيپيابي، رعايت اين نکته اصلي يعني قدرت شناسايي الزامي است. نشانگر RAPD در مقايسه با AFLP و SSR از قدرت شناسايي کمتري برخوردار است، ضمن اينکه مقدارPCR پائين در RAPD، مشکلات ناشي از تکرار پذيري را نيز بدنبال خواهد داشت. اگر چه روش معمول AFLP بطور گسترده در تهيه نقشه لينکاژي مانند جو (80)، برنج و گندم (34 و 36) بکار رفته است ولي بخاطر نياز به مقادير زياد DNAو هيبريداسيون بوسيله کاوشگر39، امروزه نشانگرهاي مبتني بر PCR مانند STS، RAPD و يا SSR براي تهيه نقشه لينکاژي کاربرد بيشتري دارند. نشانگر ريزماهواره به جهت فراواني، چندشکلي بالا، توارثپذيري و هم بارزي40 بسيار مورد توجه است (83).
2-9- کاربرد نشانگرهاي مولکولي در برنج
استفاد از تکنيکهاي نشانگري مولکولي به اصلاحگران اجازه ميدهد تا مراحل گزينش را با سرعت و دقت بيشتري انجام دهند. نشانگرها درتمام مراحل چرخـه گزينش وارد ميشوند. کاربرد آنها در شناسايي و تجزيه و تحليل افراد، تهيه نقشه ژنتيکي براي تعيين محل قرارگيري ژنها بر روي ژنوم و گزينش به کمک نشانگر براي تعقيب سرنوشت ژنها در نسلهاي متوالي است. همچنين ميتوان به کمک آنها ژن هاي دخيل در يک فنوتيپ را شناسايي و ايزوله کرد به علاوه به کمک آنها ميتوان صفت ژنتيکي پيچيده را به عوامل بنيادي سازنده آنها تفکيک کرد (30).
برنج يکي از مهمترين گياهان زراعي در دنيا بوده و تحقيق در زمينه بيولوژي آن، موضوع اصلي بسياري از دانشمندان ميباشد برنج به خاطر رشد سريع به عنوان يک تک لپهاي مناسب براي مطالعات مولکولي و ژنتيکي است. دلايل آن عبارت است از:
1. گياهي ديپلوئيد است.
2. کوچکترين ژنوم را نسبت به گياهان تک لپهاي دارد.
3. به خوبي از طريق کشت پروتوپلاست، تکثير ميشود.
4. امکان ايجاد برنج تراريخته با استفاده از DNA خارجي وجود دارد.
5. نقشه ژنتيکي آن بر اساس نشانگرهاي موفولوژيک، آيزوزايم و RFLP موجود است. اخيرا نقشههاي ژنتيکي مبتني بر SSR برنج نيز تهيه شدهاند (23، 34، 76 و 92).
برنج بعد از گوجهفرنگي و ذرت (90)، يکي از اولين گياهاني بود که نقشه ژنتيکي آن تهيه شد. اولين نقشه ژنتيکي برنج با استفاده از تجزيه و تحليل 53 گياه F2، شامل 135 نشانگر RFLP بود که به وسيله مک کوچ و همکاران (59) تهيه گرديد. اين نقشه 1398 سانتيمورگان را پوشش ميداد و 20 درصد بزرگتر از نقشه 119 نشانگري کلاسيک تهيه شده به وسيله کينوشيتا و همکاران(50) بود.
سايتو و همکاران (87) نيز با استفاده از يک جمعيت F2 برنج و نشانگرهاي RFLP، يک نقشه ژنتيکي تهيه کردند. نقشه ژنتيکي ديگري به وسيله کاوس و همکاران (20) در دانشگاه کرنل آمريکا تهيه گرديد که در آن 700 نشانگر RFLP در يک جمعيت تلاقي برگشتي برنج مکانيابي شدهاند.
نقشههاي ژنتيکي مبتني بر ريزماهوارهها (تکرار توالي تکراري ساده) نيز به وسيله محققين مختلف تهيه شده و در دسترس قرار گرفتهاند و مطالعات مک کوچ و همکاران (60) نشان داد که ريزماهوارهها روي 12 کروموزوم برنج مکانيابي شدهاند و تمنيخ و همکاران (95) اين نقشه پيوستگي را براي 312 نشانگر ريزماهواره توسعه دادند. اخيرا نقشه ژنتيکي اشباع شده برنج با استفاده از نشانگرهاي SSR تهيه شده است که در آن 2243 نشانگر ريزماهواره با فاصله متوسط کمتر از يک سانتيمورگان روي کروموزومهاي برنج شناسايي شدهاند (62). مک کوچ و همکاران (62) وجود 10000-5700 ريز ماهواره را در برنج تخمين زدهاند. در بررسي آنها نقشهاي که شامل 120 نشانگر است نشان ميدهد که اين ريزماهواره در سراسر برنج توزيع شدهاند.
2-10- انتخاب به کمک نشانگرها
از نشانگرهاي مولکولي DNA در زمينه مختلفي نظير مطالعات فيلوژنتيک، تعيين ميزان قرابت، ردهبندي گياهان زراعي، تهيه نقشههاي ژنتيکي، تعيين مکان ژنهاي کنترل کننده کيفي و کمي، انتقال ژن از گونههاي وحشي، هرم بندي ژنهاي مطلوب، تشخيص بيماريها و قرنطينه نباتي، تشخيص واريتهها و توليد گياهان تراريخته از طريق انتقال ژن به واريتههاي اصلاحي استفاده کرد. اما مهمترين کاربرد نشانگر، تسهيل انتخاب به کمک نشانگر است (9).
2-11- استفاده از نشانگرهاي مولکولي در تهيه نقشه ژنتيکي
يک نشانگر ژنتيکي براي اينکه بتواند در برنامههاي تهيه نقشه ژنتيکي مورد استفاده قرار گيرد بايد يک سري از ويژگيها را داشته باشد. فالکونر و مک کي (32) اين مشخصات را به صورت زير ذکر کردهاند:
اول اينکه بايد پلي مورفيسم بالايي داشته باشد، آنقدر که به ما اطمينان بدهد افراد مختلف جامعه حامل آللهاي مختلفي در لوکوس نشانگري هستند، چون اين چندشکلي است که براي مطالعات تنوع ژنتيکي اندازهگيري ميشود. ثانياً بايد فراواني اين نشانگرها زياد باشد به طوري که بتواند پوشش ژنومي کاملي فراهم کنند، سوم اينکه لوکوس نشانگري بايد از نظرصفت کمي و گزينشي خنثي باشد، يعني اثري روي صفت کمي نداشته باشد و مورد آخر اينکه لوکوس نشانگري براي همه ژنوتيپهاي مختلف ممکن در آن مکان نشانگري هم بارز باشد.
اخيراً دو شرط ديگر نيز اضافه شدهاند که شامل سادگي اتوماسيون و کم بودن نسبي هزينه استفاده از آنها ميباشد (67).
2- 12- ريزماهواره41
اين نشانگرهاي مبتني بر PCR، جهت توليد، نيازمند سرمايه قابل توجهي ميباشند، ليکن پلي مورفيسم بالايي نشان ميدهند و براي استفاده در نقشهيابي و انتخاب به کمک نشانگر گران نميباشند. آنها از يک توالي کوتاه (2-5 بازي) که چند بار تکرار ميشود و در مجاورت يک توالي منحصر به فرد DNA قرار دارد منتج ميشود. از تکراري بودن توالي آنها به عنوان پروب در برابر کتابخانههاي ژنومي و42cDNA جهت شناسايي کلونهايي که در آنها حضور دارند استفاده ميگردد. اين تکنيک بسيار تکرار پذير ميباشد و يک جايگاه ژني منفرد را شناسايي و نواحي فوق العاده تغيير پذير از ژنوم را هدف گيري مينمايد (58).
هزينههاي ابتدائي براي اين تکنيک بالا است، اما براي محصولاتي که نقشهيابي و انتخاب به کمک نشانگر در آنها يک ضرورت اجتناب ناپذير ميباشد، قابل توجيه است.
در ميان مجموعه عظيم نشانگرهاي موجود، توالي هاي ساده تکرار شونده مزاياي بسياري در بر دارند که اين مزايا باعث محبوبيت روزافزون آنها در برنامههاي اصلاح نباتات و دامها شده است. شناسايي آنها بر مبناي واکنش زنجيرهاي پليمراز بوده و لذا تنها به مقدرا اندکي DNA احتياج داشته، لوکوس اختصاصي بوده و براي ماشيني نمودن نيز مناسب است. بنابراين SSRها نشانگرهاي ايدهآلي براي دامنه وسيعي از کاربردها از جمله تهيه نقشه ژنتيکي، گزينش به کمک نشانگر، مطالعات ژنتيک جمعيت و تکاملي، انگشتنگاري ژنتيکي و تجزيه و تحليل شجره نامهها هستند. توسعه نشانگرهاي اليگونوکلئوتيدي که بتوان از آنها به عنوان نشانگرهاي SSR استفاده کرد، زمان بر و پرهزينه است و در هر واکنش تنها لوکوسهاي اندکي قابل شناسايي هستند (51 و 86).
اين روش بر شناخت توالي استوار است و نياز به غربال کردن43بانکهاي اطلاعاتي DNA دارد ليکن تا به امروز اطلاعات ما در مورد تواليهاي DNA چندان زياد نيست، لذا توسعه اين روش به کندي صورت ميگيرد (51 و 86).
مطالعات مک کوچ و همکاران (61) در برنج نشان داد که نشانگرهاي ريز ماهواره

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید